去年年底，中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所的周斌團隊與交通大學(xué)國際婦幼保健院的黃荷鳳團隊在Circulation期刊上發(fā)表了題為“In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia”的文章，發(fā)現(xiàn)利用AAV-CRISPR/Cas9系統(tǒng)對攜帶可導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥（FH）的致病Ldlr突變小鼠進行LDLR基因校正，能夠部分地修復(fù)低密度脂蛋白受體（LDLR）表達并有效改善LDLR突變體中的動脈粥樣硬化，為FH患者的治療提供潛在的治療方法。
Innovation 創(chuàng)新點 1. 為人類家族性高膽固醇血癥發(fā)病機制的研究建立了一種新的模型：含E208X無義點突變的LdlrE208X小鼠。 2. 通過單次注射AAV-CRISPR/Cas9對LdlrE208X小鼠進行體內(nèi)基因編輯，可以減少脂質(zhì)積累并改善動脈粥樣硬化。 背景介紹 家族性高膽固醇血癥（FH）的特點是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高和過早發(fā)生心血管疾病。FH是一種常染色體顯性遺傳病，具有基因劑量效應(yīng)，由編碼低密度脂蛋白受體（LDLR）、載脂蛋白B（APOB）或枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9（PCSK9）的基因突變引起的。其中，90％的FH是由LDLR突變導(dǎo)致的。LDLR突變可導(dǎo)致功能性LDLR的表達水平降低，肝臟對血液循環(huán)中LDL-C的清除能力下降，進而使血液循環(huán)中的LDL-C過量，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度與肝組織中LDLR的表達水平和活性密切相關(guān)。 純合子FH（HoFH）的發(fā)病率約為百萬分之一，可在嬰幼兒時期就迅速發(fā)展為嚴(yán)重的動脈粥樣硬化和心血管疾病，并導(dǎo)致死亡。雜合子FH患者（HeFH）具有功能性LDLR蛋白，因此目前的FH藥物治療（例如MG-CoA還原酶抑制劑（他汀類））通常只對HeFH有效，而高強度他汀類藥物和PCSK9抑制劑對HoFH的治療效果非常有限。這些差異表明即使低水平的LDLR表達和活性也可以顯著影響FH的嚴(yán)重程度和發(fā)展速度。針對HoFH，現(xiàn)有的治療手段包括LDL血漿置換及肝移植等，費用昂貴且存在一定風(fēng)險，因此繼續(xù)尋找和探索新的治療方法具有重要意義。 關(guān)于家族性高膽固醇血癥臨床特征及相關(guān)基因檢測的更多介紹，詳見（點擊查看原文）： 《Nature review的最新綜述：設(shè)計家族性高膽固醇血癥的適應(yīng)性護理模式所需的相關(guān)知識更新》 成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）和其相關(guān)核酸內(nèi)切酶（Cas）是近些年來發(fā)現(xiàn)和興起的一種基因編輯技術(shù)，以其高效性和簡便性廣泛應(yīng)用于不同物種的細胞基因編輯、動物模型構(gòu)建和致病基因治療等方面，極大地促進了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究發(fā)展。腺相關(guān)病毒（AAV）由于其高安全性以及穩(wěn)定長效表達，被視為最有前景的基因治療載體。利用AAV進行的基因治療目前已被批準(zhǔn)用于80多種疾病，并已用于臨床試驗。利用基因治療人類遺傳疾病是近年來醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域的熱點課題。 本研究為了確定AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對體內(nèi)體細胞進行基因編輯是否可治療由Ldlr突變引起的FH。 研究方法及結(jié)果 研究人員根據(jù)已在FH患者中發(fā)現(xiàn)的LDLR基因E207X無義突變（提前產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致LDLR蛋白無法正常表達），利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將其導(dǎo)入小鼠受精卵進行打靶（圖1），通過后續(xù)傳代交配，成功構(gòu)建LdlrE208X小鼠（純合子），并通過基因測序、反轉(zhuǎn)錄PCR、Western blot和免疫熒光染色等方法進行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶純合突變的LdlrE208X小鼠（n=6）經(jīng)高脂膳食喂養(yǎng)后，肝臟中無LDLR蛋白表達，表現(xiàn)為嚴(yán)重的動脈粥樣硬化表型（圖2），與人類的HoFH患者表現(xiàn)類似。 圖1. LdlrE208X敲入小鼠的突變策略。 圖2. 高脂膳食喂養(yǎng)后LdlrE208X小鼠主動脈動脈粥樣硬化病變的油紅O染色圖像及血漿總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白（LDL）膽固醇水平對比。 隨后利用AAV將CRISPR/Cas9系統(tǒng)（AAV-CRISPR/Cas9）送入LdlrE208X小鼠（n=6）體內(nèi)，通過小向?qū)NA（sgRNA）引導(dǎo)Cas9蛋白至特定DNA位點后，利用同源重組修復(fù)（HDR）來矯正部分肝細胞的Ldlr突變，并部分恢復(fù)其LDLR蛋白的表達（n=6）。與對照組（n=6）相比，sgRNA的AAV-CRISPR/Cas9組（每組6只）的血清總膽固醇、總甘油三酯和LDL-C均顯著降低，且主動脈粥樣硬化斑塊更小，巨噬細胞浸潤程度更低，LdlrE208X小鼠肝臟脂肪蓄積得到有效降低（圖3和圖4）。同時CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)和一些免疫指標(biāo)均顯示，成體小鼠體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶及免疫排斥反應(yīng)，支持了此次基因編輯治療的有效性和安全性。 圖3. AAV-CRISPR/Cas9治療后LdlrE208X小鼠中LDLR表達的部分恢復(fù)和動脈粥樣硬化的改善。 A. 腺相關(guān)病毒（AAV）注射、高脂飲食喂養(yǎng)及分析的實驗策略。B. 各組不同時期的體重。C. 主動脈動脈粥樣硬化病變的油紅O染色圖像。D. 小鼠主動脈根部油紅O染色圖像。E. 主動脈根部平滑肌肌動蛋白（SMA）和Ve-cad的免疫染色。F. 各組動脈粥樣硬化病變面積的量化。G. 各組動脈粥樣硬化（AS）對主動脈周長的影響。H. 肝切片油紅O染色圖像。I. 肝切片油紅O陽性區(qū)的定量。J. 小鼠血漿總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平對比。 圖4. AAV-CRISPR/Cas9治療后LdlrE208X小鼠的部分恢復(fù)及動脈粥樣硬化表型改善的示意圖。 以上結(jié)果表明，通過AAV-CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行的體內(nèi)基因編輯可能是一種有效的HoFH治療方法，同時可能有助于改善當(dāng)前降脂藥物的療效。此外也證明CRISPR/Cas9技術(shù)可作為一種應(yīng)用于人類遺傳病治療的潛在工具，但在進入臨床實驗前還必須進行更多研究測試（如大型動物試驗等）。 結(jié)論 本研究表明在體內(nèi)用AAV-CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Ldlr基因校正可部分恢復(fù)LDLR的表達，有效改善Ldlr突變小鼠的動脈粥樣硬化表型，為FH患者提供了一種潛在的治療方法。隨著全基因組測序成本的降低，對家庭成員和胎兒進行篩查將變得更加普遍。因此，在疾病進展的早期階段診斷FH，有可能實現(xiàn)通過基因校正進行早期治療。將來，AAV-CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能用于校正遺傳性心血管病中的一些生殖細胞基因突變，從而改善甚至修復(fù)疾病。 【參考文獻】 Huan Zhao, et al. In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia. Circulation. 2020, 141: 67-79.
