Md传媒沈芯语在线观看,国产一区二区播放,好大好湿好硬顶到了好爽视频

Nature Medicine：人類LRRK2功能喪失變異的影響

發(fā)布時(shí)間：2020-10-22 19:00:00來(lái)源：

近日，頂尖學(xué)術(shù)期刊Nature以封面文章形式發(fā)表了gnomAD的系列研究成果，其中Nicola Whiffin等人在Nature Medicine上也發(fā)表題為“The effect of LRRK2 loss-of-function variants in humans”的研究論文，該研究系統(tǒng)地分析了來(lái)自基因組數(shù)據(jù)庫(kù)gnomAD中測(cè)序的141,456名個(gè)體、英國(guó)生物樣本庫(kù)（UK Biobank）中全外測(cè)序的49,960名個(gè)體、及23andMe公司基因型數(shù)據(jù)庫(kù)中400多萬(wàn)名個(gè)體的LRRK2蛋白編碼基因的功能喪失性（pLoF）變異。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的解讀后，鑒定出1,455名攜帶高度可信的LRRK2pLoF變異的個(gè)體。結(jié)合此前的研究及三種變異的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，證實(shí)了該隊(duì)列中82.5％的個(gè)體的蛋白水平降低。該研究顯示LRRK2中的雜合pLoF變異降低了LRRK2蛋白水平，但這與任何特定的表型或疾病狀態(tài)均未密切相關(guān)。該研究結(jié)果證明了大規(guī)模基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和人類功能喪失性攜帶者表型分析對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)中靶標(biāo)驗(yàn)證的價(jià)值。

背景介紹

帕金森病（PD）是一種最常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響了約1%的60歲以上人群，因此迫切需要新的治療策略。約30%的家族性和3-5%的散發(fā)性帕金森病病例與遺傳因素相關(guān)。目前已知LRRK2是帕金森病的一個(gè)主要致病基因，且已知LRRK2中激酶功能獲得性變異可顯著增加帕金森病的患病風(fēng)險(xiǎn)，這表明抑制LRRK2激酶活性有望成為帕金森病的潛在治療策略。

大規(guī)模的人類遺傳學(xué)研究是發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證人類治療靶點(diǎn)的越來(lái)越強(qiáng)大的數(shù)據(jù)來(lái)源。pLoF變異是一類信息量特別豐富的遺傳變異，預(yù)測(cè)可主要或完全地消除受累等位基因的功能。這種變異是終生抑制靶基因的自然模型，可以提供有關(guān)候選靶標(biāo)的有效性和安全性的信息。在藥物靶向評(píng)估中利用pLoF變異通常需要收集大量具有遺傳特征和表型特征的個(gè)體，并對(duì)目標(biāo)基因和候選變異進(jìn)行深入的研究。

研究人員鑒定出LRRK2 pLoF變異，并評(píng)估了三個(gè)具有遺傳特征的大型個(gè)體隊(duì)列的相關(guān)表型改變。首先，在兩個(gè)大型測(cè)序隊(duì)列中注釋出LRRK2 pLoF變異，并發(fā)現(xiàn)gnomAD中的633名個(gè)體和英國(guó)生物樣本庫(kù)中的258名個(gè)體共攜帶150個(gè)獨(dú)特的LRRK2功能喪失（LoF）性候選變異，其總攜帶頻率為0.48%。整理后去除了其中不太可能導(dǎo)致真正LoF的低質(zhì)量或注釋錯(cuò)誤的變異（圖1a）。最終的數(shù)據(jù)集包括攜帶134個(gè)高度可信的pLoF變異的255名gnomAD個(gè)體和97名英國(guó)生物樣本庫(kù)個(gè)體（圖1a），其攜帶頻率為0.19%。其次，檢查了來(lái)自23andMe公司400多萬(wàn)名參與者的LRRK2 pLoF變異，并鑒定出8個(gè)用功能喪失轉(zhuǎn)錄本影響評(píng)估器（LOFTEE）推定高可信度的LRRK2pLoF變異。人工處理后，每個(gè)變異的所有推定攜帶者都提交給Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并且排除了小于5個(gè)確定攜帶者的變異。由此產(chǎn)生的隊(duì)列包括749個(gè)個(gè)體，每個(gè)經(jīng)Sanger確定的攜帶者都攜帶三種pLoF變異中的一個(gè)（圖1a）。這三個(gè)組合的數(shù)據(jù)集共提供了1455名攜帶者個(gè)體和134個(gè)獨(dú)特的LRRK2 pLoF變異。這些變異存在于所有主要的大陸種群中（圖1b），既未表現(xiàn)出任何沿著LRRK2蛋白長(zhǎng)度的明顯聚集，也未在任何已知的注釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)特定的富集或匱乏（圖1c），與真正的LoF特征一致。

圖1. 候選LRRK2 pLoF變異的注釋和管理

a. 流程圖顯示了gnomAD、英國(guó)生物樣本庫(kù)（UK Biobank）和23andMe隊(duì)列中候選LRRK2 LoF變異的篩選和管理。在23andMe隊(duì)列中鑒定出的1103名攜帶者中，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證確定了749名，其余未經(jīng)檢測(cè)。

b. gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中LRRK2 pLoF變異攜帶者的祖先分布。AFR，非洲裔/非裔美國(guó)人；AMR，美國(guó)/拉丁美洲人；ASJ，阿什肯納茲猶太人；EAS，東亞；FIN，芬蘭人；NFE，非芬蘭歐洲人；SAS，南亞。10次以上的pLoF變異以彩色顯示，其余變異則以灰色顯示。大多數(shù)LRRK2 pLoF變異在個(gè)體間極為罕見(jiàn)（攜帶頻率低于1/10000），除了兩個(gè)幾乎只存在于混合美國(guó)/拉丁美洲人群體的無(wú)義變異（Cys1313Ter和Arg1725Ter）和兩個(gè)主要為非芬蘭歐洲人特異性變異（Leu2063Ter和Arg772Ter）。所有變異蛋白的描述均以ENSP0000298910.7為參考。

c. 通過(guò)位置標(biāo)記pLoF變異的LRRK2基因示意圖，其標(biāo)記高度與gnomAD（灰色條）和英國(guó)生物樣本庫(kù)（藍(lán)色條）中的等位基因數(shù)目相對(duì)應(yīng)。其中51個(gè)外顯子用不同顏色的矩形表示不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其余外顯子為灰色。23andMe隊(duì)列中基因分型的三種變異用黑色文本標(biāo)注其樣本數(shù)目。

為了證實(shí)LRRK2 pLoF變異導(dǎo)致LRRK2蛋白水平降低，研究人員分析了具有三種獨(dú)特pLoF變異的細(xì)胞系的總蛋白裂解物。在所有情況下，與非攜帶者對(duì)照組相比，LRRK2蛋白水平肉眼可見(jiàn)地降低（圖2），這與先前的研究一致。總的來(lái)說(shuō)，此項(xiàng)研究中82.5%（1201/1455）的pLoF攜帶者具有這六個(gè)經(jīng)功能驗(yàn)證的變異。

圖2. 與無(wú)LoF變異的細(xì)胞相比，雜合型LRRK2 pLoF變異使LRRK2蛋白降低

a. 對(duì)5例無(wú)pLoF變異（LRRK2-WT）和3例雜合型（Het）pLoF變異（Cys1313Ter；12-40699748-T-A；Arg1483Ter；12-40704362-C-T）的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系進(jìn)行LRRK2和上樣對(duì)照GAPDH的免疫印跡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了十次，結(jié)果相似。

b. 對(duì)胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞中的3個(gè)對(duì)照細(xì)胞系和1個(gè)CRISPR/Cas9編輯的LRRK2雜合細(xì)胞系（Arg1693Ter-12-40714897-C-T）進(jìn)行LRRK2、α-輔肌動(dòng)蛋白（肌肉特異性）和GAPDH的免疫印跡。所有變異蛋白的描述均以ENSP0000298910.7為參考。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了五次，結(jié)果相似。

接下來(lái)，研究人員試圖確定LoF引起的長(zhǎng)期LRRK2蛋白水平降低是否會(huì)導(dǎo)致壽命明顯縮短。在gnomAD或23andMe數(shù)據(jù)集中，發(fā)現(xiàn)LRRK2 pLoF變異攜帶者和非攜帶者的年齡分布無(wú)顯著差異（圖3a），這表明對(duì)壽命無(wú)顯著影響。另外，研究人員進(jìn)行了一項(xiàng)全表型關(guān)聯(lián)研究，比較LRRK2 pLoF攜帶者和非攜帶者的366個(gè)健康相關(guān)性狀，發(fā)現(xiàn)任何個(gè)體表型與攜帶者狀態(tài)之間均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（圖3b）。

圖3. LRRK2 pLoF變異與年齡分布或任何不良表型間均無(wú)顯著相關(guān)性

a. 在gnomAD和23andMe數(shù)據(jù)集中，LRRK2 pLoF攜帶者與非攜帶者的年齡分布無(wú)顯著差異。注意，此分析基于樣本采集時(shí)的年齡。

b. 23andMe隊(duì)列中，三種LRRK2 pLoF變異的攜帶者與非攜帶者的全表型關(guān)聯(lián)研究結(jié)果的曼哈頓圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)不同的表型，并按照相關(guān)類別分組（用交替的黑點(diǎn)和灰點(diǎn)表示）。虛線代表366次試驗(yàn)的Bonferroni校正P值。邏輯回歸用于二元表型，線性回歸用于年齡、性別、基因分型平臺(tái)和前10個(gè)遺傳主成分的數(shù)量表型控制。

英國(guó)生物樣本庫(kù)資源包括30個(gè)血清和4個(gè)尿液生物標(biāo)志物的測(cè)量結(jié)果。研究者發(fā)現(xiàn)這些生物標(biāo)志物在pLoF的攜帶者和非攜帶者間無(wú)任何差異。特別是，轉(zhuǎn)化為腎功能臨床指標(biāo)的尿液生物標(biāo)志物（圖4a）及通常用于評(píng)估肝功能的六種血液生物標(biāo)志物在攜帶者和非攜帶者之間均無(wú)差異（圖4c）。同時(shí)，肺功能的肺活量測(cè)定也無(wú)差異（圖4b）。

圖4. LRRK2 pLoF攜帶者無(wú)任何肺、肝或腎功能損傷

對(duì)于所有曲線圖，每個(gè)pLoF攜帶者用青綠色的點(diǎn)表示，非攜帶者用灰色的點(diǎn)表示。平均值和1?×?s.d.用黑色圓圈和線表示。

a. 將尿生物標(biāo)志物白蛋白和肌酐轉(zhuǎn)化為腎功能的兩個(gè)臨床標(biāo)志物。pLoF攜帶者未出現(xiàn)腎功能嚴(yán)重受損的跡象。ACR，白蛋白與肌酐的比值。

b. 肺功能的年齡、性別和身高校正后的肺活量測(cè)定Z評(píng)分。FVC，用力肺活量；FEV，1?秒內(nèi)的用力呼氣量。

c. 肝功能的血清生物標(biāo)志物。堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素和肌酐曲線被截頂，分別去除47、29、92、8和27名非攜帶者。在完整的數(shù)據(jù)集上計(jì)算小提琴圖和匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。所有pLoF攜帶者均在每個(gè)繪圖區(qū)內(nèi)。

研究人員承認(rèn)此項(xiàng)研究存在多種局限性。首先，研究所依賴的異質(zhì)性表型數(shù)據(jù)主要來(lái)自自我報(bào)告的問(wèn)卷調(diào)查。23andMe和gnomAD數(shù)據(jù)集都只記錄了招募時(shí)的年齡，這并非一個(gè)理想的壽命指標(biāo)，與帕金森病的典型發(fā)病年齡相比，參與者相對(duì)年輕。此外，在目前的樣本量下，只能檢測(cè)到對(duì)壽命的強(qiáng)影響。由于是有針對(duì)性的基因分型而非測(cè)序數(shù)據(jù)，因此對(duì)23andMe隊(duì)列中LRRK2 pLoF變異的調(diào)查必然不完全。另外，也未直接評(píng)估LRRK2 pLoF變異是否會(huì)降低激酶活性，而是將蛋白水平的降低作為一個(gè)指標(biāo)。若發(fā)生生物代償，LRRK2的終生LoF可能不等同于治療性失活。最后，LRRK2 pLoF變異自然發(fā)生的低頻率導(dǎo)致可用于評(píng)估每種生物標(biāo)記物和表型的攜帶者相對(duì)較少，這意味著無(wú)法很好地檢測(cè)由LRRK2單倍劑量不足而引起的微小或罕見(jiàn)的臨床表型。然而，此項(xiàng)研究表明，任何與LRRK2部分降低相關(guān)的臨床表型都可能比早發(fā)性帕金森病更為良性。

總結(jié)

該項(xiàng)研究為伴有全面變異解讀、具有遺傳特征和表型特征的特大型隊(duì)列，在探索候選藥物靶點(diǎn)的安全性時(shí)提供了一個(gè)重要的原則性證據(jù)。在未來(lái)的幾年里，能得到數(shù)十萬(wàn)深入分型個(gè)體和/或用于基于基因型研究的再聯(lián)系個(gè)體的完整外顯子組或基因組序列數(shù)據(jù)，再結(jié)合對(duì)候選pLoF變異的深入解讀和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將為治療靶點(diǎn)驗(yàn)證以及更廣泛的人類基因生物學(xué)研究提供強(qiáng)有力的資源。